ISOLASI DNA DAN PURIFIKASI
Penelitian dasar dalam bioteknologi adalah kemampuan memanipulasi DNA. Sebelum pengerjaan DNA rekombinan, peneliti membutuhkan sebuah metode dalam mengisolasi DNA dari organisme. Mengisolasi DNA dari bakteri sangat mudah karena sel memiliki struktur dinding sel dan membran sell. Bakteri seperi E. Coli merupakan organisme yang lebih diutamakan terkait manipulasi genetic karena mudah mengisolasi DNA nya. E. coli menjaga DNA genomic dan plasmidnya dalam. Sedangkan ukuran keduanya berbeda sehingga mudah dipisahkan.
Untuk membebaskan DNA dalam sel, sel membrane harus dihancurkan terlebih dahulu. Apda bakteri, enzim Lysozyme menghancurkan peptidoglikan yang menyusun dinding sel. Kemudian, detergen menghacurkan membrane sel dengan memecah dua lapisan lipid. Untuk organisme lain berbeda tergantung senyawa penyusunnya. Sel hewan dan tanaman harus terlebih dahulu digiling untuk membebaskan komponen dalam sel. Sel tanaman harus dihancurkan secara mekanik untuk merusak dinding sel, kemudian jaringan dinding dipecahkan dengan enzim untuk memutuskan ikatan polimer menjadi monomer.
Ketika komponen intra seluler dipisahkan dari struktur luar dengan sentrifugasi atau dengan ekstraksi kimia. Centrifugasi dapat memisahkan komponen berdasarkan ukuran, karena laju pengendapan molecule besar akan lebih cepat disbanding molekul kecil. Contohnya, setelah dinding sel di pecahkan, ukuran fragmennya akan bervariasi. Sentrifugasi akan menyebabkan DNA membentuk pellet, numun dinding sel yang terlarut akan tetap dalam larutan. Ektraksi kimia menggunakan phenol untuk menghilangkan protein yang tidak diinginkan seperti Histon. Pheol adlaah asam yang larut dalam 60 – 70% senyawa organic terutama protein. Phenol tidak larut dalam air, dan ketika dicampurkan dengan air sample DNA dan protein, akan menyebabkan dua fraksi yaitu air dan seperti minyak. Protein akan larut dalam lapisan phenol dan DNA pada lapisan cair. Dua fasa dipisahkan dengan sentrifugasi dan lapisan DNA dipindahkan dari phenol. Ketika protein dibuang, sampel masing mengandung RNA besama DNA. Dengan menggunakan enzim RNAase RNA akan degrasasi.
Eletrophoresis Memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya
Elektroporesis Gel beserta pewarnaan dengan ethidium bromide digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Gel pada elektroporesis Gel mengandung agarose, yaitu ekstrak polisakarida dari rumput laut yang bersifat seperti gelatin. Agarose merupakan bubuk yang larut dalam air hanya ketika dipanaskan. Seletelah dingin, agar akan mengeras. Untuk visualisasi DAN, agarose dibentuk pada cetakan persegi yang disisipkan sisir pada salah satu ujung agar untuk membuat sumur atau lobang. Setelah gel memadat, sisir akan diangkat dan membentuk sumur.
Elektorforesis gel menggunakan listrik untuk memisahkan molecule DNA berdasakan ukurannya. Agarose direndam pada tangka yang memiliki eletroda positif pada satu ujungnya dan negative pada ujung lainya.
DNA sample diloading kedalam sumur/ lobang kemudian dialirkan arus listrik. DNA akan bermigrasi melalui gel. Fosfat DNA bermuatan negated jadi akan berpindah dari negative ke positif, agarose yang dipolimerisasi bertindak seperti saringan dengan lobang yang sangat kecil antara rantai polimer agar. DNA bermigras melalui pori ini. Agarose memisahkan DNA dengan berdasarkan ukuran karena bagian yang besar akan bermigrasi lebih lambat.
Untuk memvisualisasikan DNA, gel agarose akan dihilangkan dari tank kemudian direndam kedalam larutan etidium bromide. Pewarna ini akan membentuk interkalasi antara basa DNA/ RNA. Molekul DNA pada ukuran yang sama pada umumnya dari pita yang tebal dan ukurannya akan dapat ditentukan dengan membandingkan dengan standar berat molekul yang diloading pada wel yang berbeda. Karena standar tersebut diketahui ukurannya secara spesifik.
Ukuran DNA yang diuji mempengaruhi jenis gel yang digunakan. Standarnya adalah agarose, namun DNA yang ukuran kecil dari 50 hingga 1000 bp lebih baik digunakan polyacrylamide. Gel ini dapat memisahkan fragmen DNA yang berbagai macam. Untuk ukuran yang sangat besar (10.000 – 10 jt bp) agarose digunakan namun arus digantikan dnegan dua arah. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Setiap perubahan arah meloloskan DNA ukuran besar yang tersangkut dalam pori agar. Kemudian menyebabkan meraka bermigrasi lebih jauh. Akhirnya elektroforesis dapat memisahkan fragmen yang memiliki selisih yang kecil.
Enzim Restriksi Memotong DNA, Ligasi menyambungkan DNA
Kemampuan untuk mengisolasi, memisahkan dan memvisualisasi fragmen DNA tidak akan berguna jika tidak ada metode untuk memotong DNA kedalam ukuran yang bervariasi. Pada kenyataanya, Kejadian ini terjadi secara natural dengan bantuan enzim restriksi atau restriction endonucleases merupakan kuncinya. Enzim bakteri ini dapat berikatan dengan sisi pengenalan spesifik pada DNA dan memotong pada kedua untai DNA. Ini berevolusi untuk melindungi bakteri dari DNA asing, seperti Virus. Enzim tidak memotong DNA nya sendiri karena mereka dimetilasi, yaitu jika Sekues pengenalan dimetilasi, maka enzim tidak dapat berikatan.
Perbedaan pemotongan menentukan jenis enzim restriksi. Enzim restriksi tipe I memotong DNA 1000 atau lebih pasang basa dari sisi pengenalannya. Tipe II memotong ditengah-tengah sekuens pengenal dan pada umumnya digunakan untuk rekayasa genetik. Enzim tipe II dapat memotong antara kedua untaian simetris yang dikenal dengan pomotongan Blunt end (ujung buntu) atau mereka dipotong dengan sisi yang berbeda pada setiap unataian yang dikenal dengan ujung runcing (Cohesive end). Sekuens pengenalan pada enzim tipe II biasanya bersifat palindrome yaitu pembacaan dari arah yang sama pada masing-masing untai adalah sama.
Jumlah sekuens pengenalan menentukan kemungkinan pemotongan. Penemuan sekuens untuk sisi pengenalan empat basa lebih besar dibandingkan dengan enam basa pengenal. Jadi akan menyebabkan lebih sedikit, fragmen panjnag, enzim restriksi dengan enam atau lebih basa pengenalan.
Ketika dua sample DNA dipotong dengan enzim yang menyebabkan potongan sticky end, semua fragmen akan meninggalkan sekuen yang bergantungan. Ini akan membuat fragmen DNA dengan dua sumber dapat digabungkan bersama. Fragmen tersebut dihubungkan dengan DNA ligase, enzim yang sama yang menyatukan fragmen okazaki selama replikasi. Ligase yang umum digunakan adalah T4 Bacteriphage. Ligase mengkatalisis antara 3’-OH pada untai satu dengan 5’-PO4 pada DNA lainya. Ligase bekerja lebih efisien pada sticky end namaun juga bekerja pada blunt end.
