ISOLASI DNA DAN PURIFIKASI

Penelitian dasar dalam bioteknologi adalah kemampuan memanipulasi DNA. Sebelum pengerjaan DNA rekombinan, peneliti membutuhkan sebuah metode dalam mengisolasi DNA dari organisme. Mengisolasi DNA dari bakteri sangat mudah karena sel memiliki struktur dinding sel dan membran sell. Bakteri seperi E. Coli merupakan organisme yang lebih diutamakan terkait manipulasi genetic karena mudah mengisolasi DNA nya. E. coli menjaga DNA genomic dan plasmidnya dalam. Sedangkan ukuran keduanya berbeda sehingga mudah dipisahkan.

Untuk membebaskan DNA dalam sel, sel membrane harus dihancurkan terlebih dahulu. Apda bakteri, enzim Lysozyme menghancurkan peptidoglikan yang menyusun dinding sel. Kemudian, detergen menghacurkan membrane sel dengan memecah dua lapisan lipid. Untuk organisme lain berbeda tergantung senyawa penyusunnya. Sel hewan dan tanaman harus terlebih dahulu digiling untuk membebaskan komponen dalam sel. Sel tanaman harus dihancurkan secara mekanik untuk merusak dinding sel, kemudian jaringan dinding dipecahkan dengan enzim untuk memutuskan ikatan polimer menjadi monomer.

Ketika komponen intra seluler dipisahkan dari struktur luar dengan sentrifugasi atau dengan ekstraksi kimia. Centrifugasi dapat memisahkan komponen berdasarkan ukuran, karena laju pengendapan molecule besar akan lebih cepat disbanding molekul kecil. Contohnya, setelah dinding sel di pecahkan, ukuran fragmennya akan bervariasi. Sentrifugasi akan menyebabkan DNA membentuk pellet, numun dinding sel yang terlarut akan tetap dalam larutan. Ektraksi kimia menggunakan phenol untuk menghilangkan protein yang tidak diinginkan seperti Histon. Pheol adlaah asam yang larut dalam 60 – 70% senyawa organic terutama protein. Phenol tidak larut dalam air, dan ketika dicampurkan dengan air sample DNA dan protein, akan menyebabkan dua fraksi yaitu air dan seperti minyak. Protein akan larut dalam lapisan phenol dan DNA pada lapisan cair. Dua fasa dipisahkan dengan sentrifugasi dan lapisan DNA dipindahkan dari phenol. Ketika protein dibuang, sampel masing mengandung RNA besama DNA. Dengan menggunakan enzim RNAase RNA akan degrasasi.

Eletrophoresis Memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya

Elektroporesis Gel beserta pewarnaan dengan ethidium bromide digunakan untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya. Gel pada elektroporesis Gel mengandung agarose, yaitu ekstrak polisakarida dari rumput laut yang bersifat seperti gelatin. Agarose merupakan bubuk yang larut dalam air hanya ketika dipanaskan. Seletelah dingin, agar akan mengeras. Untuk visualisasi DAN, agarose dibentuk pada cetakan persegi yang disisipkan sisir pada salah satu ujung agar untuk membuat sumur atau lobang. Setelah gel memadat, sisir akan diangkat dan membentuk sumur.

Elektorforesis gel menggunakan listrik untuk memisahkan molecule DNA berdasakan ukurannya. Agarose direndam pada tangka yang memiliki eletroda positif pada satu ujungnya dan negative pada ujung lainya.

DNA sample diloading kedalam sumur/ lobang kemudian dialirkan arus listrik. DNA akan bermigrasi melalui gel. Fosfat DNA bermuatan negated jadi akan berpindah dari negative ke positif, agarose yang dipolimerisasi bertindak seperti saringan dengan lobang yang sangat kecil antara rantai polimer agar. DNA bermigras melalui pori ini. Agarose memisahkan DNA dengan berdasarkan ukuran karena bagian yang besar akan bermigrasi lebih lambat.

Untuk memvisualisasikan DNA, gel agarose akan dihilangkan dari tank kemudian direndam kedalam larutan etidium bromide. Pewarna ini akan membentuk interkalasi antara basa DNA/ RNA. Molekul DNA pada ukuran yang sama pada umumnya dari pita yang tebal dan ukurannya akan dapat ditentukan dengan membandingkan dengan standar berat molekul yang diloading pada wel yang berbeda. Karena standar tersebut diketahui ukurannya secara spesifik.

Ukuran DNA yang diuji mempengaruhi jenis gel yang digunakan. Standarnya adalah agarose, namun DNA yang ukuran kecil dari 50 hingga 1000 bp lebih baik digunakan polyacrylamide. Gel ini dapat memisahkan fragmen DNA yang berbagai macam. Untuk ukuran yang sangat besar (10.000 – 10 jt bp) agarose digunakan namun arus digantikan dnegan dua arah. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE). Setiap perubahan arah meloloskan DNA ukuran besar yang tersangkut dalam pori agar. Kemudian menyebabkan meraka bermigrasi lebih jauh. Akhirnya elektroforesis dapat memisahkan fragmen yang memiliki selisih yang kecil.

Enzim Restriksi Memotong DNA, Ligasi menyambungkan DNA

Kemampuan untuk mengisolasi, memisahkan dan memvisualisasi fragmen DNA tidak akan berguna jika tidak ada metode untuk memotong DNA kedalam ukuran yang bervariasi. Pada kenyataanya, Kejadian ini terjadi secara natural dengan bantuan enzim restriksi atau restriction endonucleases merupakan kuncinya. Enzim bakteri ini dapat berikatan dengan sisi pengenalan spesifik pada DNA dan memotong pada kedua untai DNA. Ini berevolusi untuk melindungi bakteri dari DNA asing, seperti Virus. Enzim tidak memotong DNA nya sendiri karena mereka dimetilasi, yaitu jika Sekues pengenalan dimetilasi, maka enzim tidak dapat berikatan.

Perbedaan pemotongan menentukan jenis enzim restriksi. Enzim restriksi tipe I memotong DNA 1000 atau lebih pasang basa dari sisi pengenalannya. Tipe II memotong ditengah-tengah sekuens pengenal dan pada umumnya digunakan untuk rekayasa genetik. Enzim tipe II dapat memotong antara kedua untaian simetris yang dikenal dengan pomotongan Blunt end (ujung buntu) atau mereka dipotong dengan sisi yang berbeda pada setiap unataian yang dikenal dengan ujung runcing (Cohesive end). Sekuens pengenalan pada enzim tipe II biasanya bersifat palindrome yaitu pembacaan dari arah yang sama pada masing-masing untai adalah sama.

Jumlah sekuens pengenalan menentukan kemungkinan pemotongan. Penemuan sekuens untuk sisi pengenalan empat basa lebih besar dibandingkan dengan enam basa pengenal. Jadi akan menyebabkan lebih sedikit, fragmen panjnag, enzim restriksi dengan enam atau lebih basa pengenalan.

Ketika dua sample DNA dipotong dengan enzim yang menyebabkan potongan sticky end, semua fragmen akan meninggalkan sekuen yang bergantungan. Ini akan membuat fragmen DNA dengan dua sumber dapat digabungkan bersama. Fragmen tersebut dihubungkan dengan DNA ligase, enzim yang sama yang menyatukan fragmen okazaki selama replikasi. Ligase yang umum digunakan adalah T4 Bacteriphage. Ligase mengkatalisis antara 3’-OH pada untai satu dengan 5’-PO­₄ pada DNA lainya. Ligase bekerja lebih efisien pada sticky end namaun juga bekerja pada blunt end.

https://www.youtube.com/watch?v=tcPgdR9_t64

https://www.youtube.com/watch?v=U2cKywEn6KY

PLASMID DAN VIRUS PADA BIOTEKNOLOGI

DNA membutuhkan sejumlah karakteristik untuk dapat disebut vector. Hal yang terpenting adalah dapat bereplikasi didalam cel inang, sehingga sejumlah cetakan DNA inang akan dapat diproduksi dan diturunkan pada keturunanya. Sebuah vector cloning harus kecil, idealnya kurang dari 10 kb karena molekul yang besar sewaktu purifikasi cenderung rusak selama purifikasi, dan juga sulit untuk dimuanipulasi. Dua jenis molekul DNA yang termasuk dalam kriteria dapaat ditemukan pada sel bakteri adalah: Plasmid dan kromosom bacteriophage.

1. Plasmid

Plasmid merupakan molekul sirkular DNA yang regulasinya tidak bergantung kpeada keberadaan DNA bakteri. Plasmid hamper selalu memiliki satu atau lebih gen, yang seringkali berhubungan dengan penampakan bakteri. Contohnya, kemampuan untuk resistensi terhadap antiobiotik seperti chloramphenicol atau aphicillin. Pada pengerjaan laboratorium resistensi antibiotic sering digunakan sebagai marker selektif untuk memastikan kultur bakteri mengandung plasmid tertentu.

Sejumlah plasmid mengandung sedikitknya satu sekuen DNA yang berperan sebagai Origin of Replication, sehingga mereka dapat diperbanyak dalam sel secara bebas tanpa intervensi DNA komosom bakteri. Plasmid memanfaatkan enzim replikase pada Bakteri unguk memperbanyak diri mereka, sedangkan sejum;ahn gene mengkode sejumlah enzim special untuk replikasi plasmid. Plasmid pada umunya dapat bereplikasi dengan menyisispkan mereka kedalam kromosom bakteri. Plasmid itegratif ini dikenal dengan Episome yang dapat dijaga selama proses divisi sel namun pada tahap lain mereka merupakan elemen yang independen.

1. Ukuran dan Jumlah Cetakan

Ukuran dan jumlah cetakan plasmid merupakan hal yang penting pada saat cloning. Jumlah cetakan/ copy number mengacu kepada jumlah molekul sebuah plasmid pada bakteri. Factor yang mengatur jumlah cetakan masih belum diketahui. Sejumlah plasmid, terutama yang besar, sangat ketat/ Stringent dan memilki jumlah cetakan yang rendah. Selain itu ada juga plasmid relaxed, yang hadir pada jumlah yang sangat banyak pada sel.

2. Konjugasi dan Kompatibilitas

Plasmid terbagi dua grup: conjugative dan non-conjugative. Conjugative plasmid dikarakterisasi oleh kemampuannya untuk melakukan hubungan seksual antara sel bakteri, yang merupakan proses yang dapat menghasilkan sejumlah plasmid conjugative dan terpencar dari satu sel ke seluruh sel pada kultur bakteri. Konjugasi dan transfer plasmid dikontrol oleh gen tra yang hanya terdapat pada plasmid conjugative.

Sejumlah jenis plasmid dapat ditemukan pada sel tunggal, termasuk lebih dari satu plasmid konjugatif yang berbeda pada satu waktu. Kenyataanya, Sel E. Coli dikenal mengandung lebih dari tujuh plasmid. Untuk keberadaan bersama pada sel yang sama, maka merkan harus Compatible.

3. Klasifikasi Plasmid

Plasmid secara natural memiliki karakteristik tersendiri yang ditandai oleh gen plasmid. Terdapat lima jenis plasmid:

1. Fertility Plasmid or F plasmid – hanyalah yang memilki gen tra dan tidak memilki karakteristik selain kemampuan melakukan konjugasi. Contohnya, F plasmid pada coli
2. Resistance atau R plasmid – membawa gen yang memberikan ketahanan pada bakteri terhadap satu atau beberapa jenis antibiotic. R plasmid sangat penting pada mikrobiologi klinik. Contohnya RP4, yang sering ditemukan pada Pseudomonas.
3. Col Plasmid – yang mengkode colicins, protein yang membunuh bakteri, seperti contohnya ColE1 pada coli
4. Degradatif plasmid – memungkinkan bakteri inang memotabolisme molekul yang tidak umum seperti Toluena dan Asam Salisilat, seperti contohnya, TOL pada Pseudomonan putida.
5. Virulence Plasmid – yang memberikan patogenesitas pada bakteri inang, ini termasuk TI-plasmid pada Agrobakterium tumefaciens.
6. Plasmid pada organisme selain bakteri

Mesikupun plasmid pada umunya berada pada bakteri bukan berarti tidak ada pada bakteri lain. Eukariotik plasmid yang dikenal jelas adalah plasmid yang terdapat pada Saccharomyces cerevisiae.

1. Bakteriophage

Bakteriopage, atau phage merupakan virus yang secara khusus menginfeksi bakteri, sama seperti virus, phage sangat sederhana, mengandung DNA (kadang kala RNA) yang membawa sejumlah gen, termasuk beberapa untuk replikasi, yang ditutupi oleh coat atau kapsid yang terbuat dari molekul protein.

Figure 3. betuk umum struktur phage, a) Head and tail (eg. λ) b) Filamen (e.g. M13)

1. Siklus Infeksi Phage

Pola infeksi pada umumnya:

• Phage partikel menempel pada bagian luar bakteti dan menginjeksikan DNA kromosomnya kedalam sel
• Molekul DNA direplikasi, pada umumnya dengan enzim spesifika dari phage yang dikode oleh gen didalam kromosom phage
• Gen lainnya langsung mensintersis komponen protein kapsid, dan partakel virus lain yang di satukan dan dilepaskan dari bakteri.

Semua proses ini terjadi kurang dari 20 menit. Tipe infeksi ini disebut Lytic cycle, yang melepaskan partikel baru yang berhubungan dengan hancurnya sel bakteri. Secara garis besar siklus ini ditandai dengan replikasi DNA yang diikuti lansung oleh sintesis kapsid dan molekul DNA atau partikel dilepaskan dari sel. Contohnya M13

1. Lysogenic phages

Berbeda dengan Lytic, Infeksi Lysogenic dicirikan dengan mempertahankan DNA molecule Phage pada bakreri, mungkin saja hingga ribuan pembelahan. Pada infeksi Lysogenic DNA phage disisipkan kedalam genom bakteri, sama seperti episomal insertion. Bentuk integrative Phage (dikenal dnegan Phophage) pasif. dan bakteri yang membawa prophage pada umumnya tidak dapat dibedakan daric cel yang tidak terinfeksi. Bagaimanapun, prophage akhirnya akan dilepaskan dari genom host dan phage kembali pada lytic mode. Siklus infeksi pada lambda (λ) pada umumnya lysogenic. Pembelahan yang terbatas pada lisogenik mengikuti siklus infeksi yang berbeda.

1. Organisasi gen pada λ DNA

Phage λ biasanya memiliki kepada dan ekor. DNA terkandung dalam struktur polyhedral struktur kepada dan ekor yang menempel kepada permukaan sel bakteri sehingga material genetic dapat diinfeksikan.

DNA λ berukuran 49kb yang pada umumnya tersusun sangat rapi. Teknik gen mapping secara intensif menunjukan gen pada Phage λ terorganisasi secara cluster contoh gen yang mengkode component kapsid berada pada molekul ketiga sebelah kiri, sedangkan gen yang meregulasi integrase prophage dikelompokkan pada bagian tengah.

1. Bentuk Linear dan Circular λ DNA

Karakteristik kedua λ adalah linera, dengan dua ujung bebas yang mewakili DNA hadil didalam struktur kepala. Molekul linear ini mengandung dua untaian komplementer DNA. Meskipun demikian, pada setiap ujuang molekul ada 12 nukleotida terbentang satu untai. Dua untai tunggal tersebut adalah komplementer, sehingga bisa berpasangan ujung satu dengan ujung lain dan membentuk circular double strended.

Figure 4. λ peta genetic

Figure 5. Bentuk sirkular dan Linear DNA λ

Untaian tunggal yang saling komplementer sering mengacu pada sticky end atau cohesive end, karena berpasangan sehingga dapat menempel bersama pada molekul ujung. Λ cohesive end disebut cos site yang memerankan dua peran pentiing selama infeksi. Pertama, mereka dapat menginjeksikan liner DNA kedalam sel untuk diubah menjadi circuler, yang penting untuk persyaratan insersi kedalam genom bakteri.

Peran kedua adalah cos site yaitu setelah prophage dikeluarkan dari sel genom. Pada tahapan ini sejumlah λ DNA baru diproduksi dengan RCR

1. M13- Phage Filamen

M13 merupakan contoh Phage yang berbentuk filament dan sangat berbeda dengn λ. DNA M13 lebih kecil daripada genom λ hanya 6407 bp sirkular dan tidak umum dijumpai untai tunggal.

Ukuran yang lebih kecil artnya memiliki sedikit gen sibandingkan dengan λ, hal ini karena kapsid M13 dibentuk dari sejumlah copy hanya 3 protein sedangkan λ melibatkan 15 protein untuk membentuk struktu kepala ekor.

Injeksi DNA M13 kedalam E. coli terjadi melalui pilus, struktur yang menghubungkan dua cel selama conjugasi sexual. Ketika masuk kedalam sel untai tunggal DNA virus bertindak sebagai template untuk mensintesis sequence komplementer. Sehingga menghasilkan DNA untai ganda. Molekul tidak disisipkan kedalam geneom bakteri, namun mereplikasi hingga lebih dari 100 copy. Ketika bakteri membelah, setiap anak akan menerima sejumlah copy. Partike phage baru kemudian dilanjutkan untuk digabungkan dan dilepaskan. Sekitar 1000 phage baru diproduksi selama satu siklus/ geneerasi sel.

Beberapa karakteristik M13 yang menarika adalah. Genomnya yang kurang dari 10 kb, sehingga masuk dalam kategori vector yang ideal. Kemudian, untai ganda replicative form (RF) phage M13 bersifat sama dengan plasmid. Yang bisa digunakan untuk eksperiment.

1. Virus sebagai vector cloning untuk oranisme lain

Sejumlah organisme hidup diinfeksi virus sehingga sangat menarik untuk dijadikan vector transformasi pada organisme tingkat tinggi. Beberapa virus eukariotik telah digunakan untuk vector cloning untuk sejumlah aplikasi: sebagai contoh, manusia adenovirus yang digunakan sebagai gen terapi, baculovirus yang digunakan dalam sintesis protein pharmasi pada cel seranga, caulimovirus and geminivitrus yang digunakan untuk cloning tanaman.

https://www.youtube.com/watch?v=5ffl-0OYVQU

https://www.youtube.com/watch?v=0Mw-0G2m6uE